Area Diagnostica

I tumori in fase di crescita avanzata, infiltranti e/o metastatizzanti, rappresentano una delle principali sfide della medicina moderna. Oltre ai classici approcci chemioterapici sono stati progressivamente sviluppati nuovi protocolli basati sull’uso di farmaci innovativi a bersaglio molecolare.

L’attività svolta dal Laboratorio di Biologia Molecolare nella caratterizzazione biologica delle neoplasie solide ha permesso di caratterizzare e classificare i tumori umani, al fine di applicare un trattamento specifico per ogni fenotipo, massimizzando l’indice terapeutico. I risultati ottenuti dallo studio delle mutazioni geniche nel Non Small-Cell Lung Cancer (NSCLC), nel carcinoma del colon-retto, nel tumore stromale gastrointestinale (GIST) e nel melanoma in stadio avanzato, hanno confermato che la strategia farmacogenetica può essere usata per una scelta razionale di terapie mirate per il singolo paziente.

Esami predittivi di risposta alla terapia

1. Esami predittivi di risposta alla terapia su Tessuto Tumorale
2. Esami predittivi di risposta alla terapia su Biopsia Liquida
3. Esami di Farmacogenetica
4. Analisi dell’Instabilità dei Microsatelliti (MSI) 

Test genetici

1. Analisi di BRCA1 e 2
2. Test genetici per la predisposizione al cancro

1. ESAMI PREDITTIVI DI RISPOSTA ALLA TERAPIA SU TESSUTO TUMORALE

A cosa serve

La caratterizzazione biomolecolare delle alterazioni geniche dei tumori e la complessa interazione tra le molecole dello stesso network rappresenta il fondamento su cui si basa l’oncologia di precisione. Il concetto di oncologia di precisione prevede la ricerca di specifiche alterazioni di una determinata sequenza genica, RNA o proteina che qualora presenti in un paziente con una specifica neoplasia, possano essere utilizzate come target di un trattamento individualizzato. Pertanto il paziente candidato al test viene selezionato sulla base delle caratteristiche molecolari del proprio tumore, per uno specifico trattamento target che gli consenta di giovare di un potenziale beneficio clinico maggiore e più duraturo rispetto alla terapia convenzionale, promuovendo così l'appropriatezza della terapia.

A chi è rivolta

L'attività del Laboratorio di Biologia Molecolare è rivolta a pazienti oncologici che necessitano di analisi diagnostiche finalizzate ad una personalizzazione delle terapie.

È svolta su richiesta dei medici oncologi e di altri specialisti, sia interni che esterni all'Azienda Ospedaliera di Perugia.

I tumori per i quali sono attualmente disponibili analisi biomolecolari per la risposta ai farmaci a target molecolare sono:

• Tumore del polmone (Non Small-Cell Lung Cancer-NSCLC): analisi mutazionale dei geni EGFR e KRAS, analisi dei trascritti di fusione ALK, ROS1

Tra le alterazioni molecolari più frequenti nel NSLC vi sono: le mutazioni del gene EGFR (10-15% dei pazienti caucasici), KRAS (20-30%), i riarrangiamenti di ALK (3-7%), ROS1 (1-2%), RET (1-2%) e NTRK (0.5-1%), le mutazioni del gene BRAF (2-4-%), ERBB2 (1-2%) e le amplificazioni o mutazioni del gene MET (2-4%). In Italia ad oggi sono approvati e rimborsati solo i farmaci inibitori delle tirosino-chinasi di EGFR, ALK e ROS1, le altre alterazioni possono essere utili ai fini dell’accesso a studi clinici o ai programmi di accesso allargato.

Tra le mutazioni di EGFR, sono state identificate mutazioni attivanti a carico degli esoni 18, 19, 20 e 21. Le più frequenti, anche definite come comuni o classiche, sono le delezioni dell’esone 19 (Ex19dels) e la mutazione puntiforme dell’esone 21 (L858R), che insieme rappresentano circa il 90% di tutte le mutazioni di EGFR riscontrate in questi pazienti. Gli inibitori tirosino-chinasici di EGFR (TKI) rappresentano il trattamento di I linea raccomandato nei pazienti con NSCLC avanzato e mutazioni classiche.

Altri marcatori molto importanti in questi pazienti ai fini della scelta del regime terapeutico più appropriato sono ALK e ROS1. La presenza del riarrangiamento identifica un sottogruppo di pazienti candidabili al trattamento con inibitori tirosino-chinasici di ALK.

• Tumore colon-retto: analisi mutazionale dei geni KRAS, NRAS e BRAF

Nel paziente con carcinoma del colon-retto metastatico, al momento di intraprendere un trattamento, per impostare una corretta programmazione terapeutica, deve essere effettuata la valutazione dello stato mutazionale dei geni KRAS (esoni 2, 3 e 4) e NRAS (esoni 2, 3 e 4). La presenza di mutazioni somatiche nei suddetti geni infatti, è un meccanismo di resistenza alla terapia con anticorpi monoclonali anti-EGFR.

Circa il 35% dei pazienti con tumore metastatico del colon-retto presentano mutazioni somatiche a carico del gene KRAS mentre il 3-5% di questi pazienti presentano mutazioni somatiche a carico del gene NRAS.

Pertanto EMA e AIFA hanno ristretto l’impiego di anticorpi monoclonali anti-EGFR ai soli pazienti RAS wild type.

Le mutazioni di BRAF invece sono presenti in circa il 10% dei pazienti con carcinoma del colon-retto, la mutazione più frequente è la V600E e la presenza di tale mutazione è associata ad una peggiore prognosi.

• Melanoma: analisi mutazionale del gene BRAF

Nel melanoma, il gene BRAF è mutato nel 45-50% dei casi; la mutazione più diffusa (85-90% dei casi) è rappresentata dalla sostituzione V600E. Le rimanenti mutazioni BRAF si verificano spesso sullo stesso codone: V600K (la più frequente <10% dei casi), V600D e V600R.

La mutazione BRAF-V600 ha oggi un significato prevalentemente predittivo nella gestione del paziente con melanoma, in quanto identifica una potenziale sensibilità al trattamento con la combinazione di BRAF e MEK inibitori.

• Tumore stromale gastrointestinale (GIST): analisi mutazionale del gene KIT

L’analisi degli esoni 9 e 11 del gene KIT è necessaria per selezionare la migliore strategia terapeutica nei pazienti con tumore stromale gastrointestinale (GIST) in stadio avanzato. Più del 80% dei GIST è caratterizzato da una mutazione specifica a carico del gene KIT, di queste circa il 65% è presente sull’esone 11. Tali mutazioni sono responsabili di un’attivazione costitutiva del recettore, che sembra rivestire un ruolo cardine nel processo di sviluppo di questi tumori. Lo stato mutazionale di KIT sembra essere predittivo della risposta clinica agli inibitori tirosin-chinasici di KIT.

Metodiche per lo studio delle alterazioni molecolari del DNA

I test sono effettuati su DNA di pazienti con tumore del polmone NSCLC, tumore del colon-retto e melanoma, estratto da sezioni di tessuto tumorale fissato in formalina e incluso in paraffina (FFPE), in cui sia indicata la zona tumorale e la relativa percentuale di cellule tumorali presenti.

Le tecnologie utilizzate sono:

• Analisi NGS mediante il pannello Ion AmpliSeq Colon and Lung Cancer Research Panel V2

Presso il Laboratorio di Biologia Molecolare viene utilizzato il Pannello Ion AmpliSeq Colon and Lung Cancer Research Panel V2 (Thermo Fisher Scientific) che prevede l'analisi molecolare per la ricerca di mutazioni in 22 geni (KRAS, EGFR, BRAF, PIK3CA, AKT1, ERBB2, PTEN, NRAS, STK11, MAP2K1, ALK, DDR2, CTNNB1, MET, TP53, SMAD4, FBXW7, FGFR3, NOTCH1, ERBB4, FGFR1, FGFR2) potenzialmente associati allo sviluppo neoplastico.

Il sequenziamento NGS viene eseguito su piattaforma Ion Torrent PGM o Ion Torrent S5 (Thermo Fisher Scientific), l'analisi dei dati viene effettuata tramite le pipeline dei software Ion Reporter e Torrent Suite, per la visualizzazione delle "reads" viene utilizzato IGV (Integrative Genomics Viewer), l’allineamento e la chiamata delle varianti viene fatto rispetto al genoma di riferimento hg19.

La sensibilità analitica del test consente la visualizzazione delle varianti fino ad una frequenza allelica del 3%.

• Analisi mediante sequenziamento automatizzato diretto

L’analisi dei principali esoni dei geni EGFR (esoni 18-19-20-21), KRAS (esoni 2-3-4), BRAF (esoni 11-15), MET (esoni 14-15), ERBB2 (esone 20), PIK3CA (esoni 10-21), KIT (esoni 9-11) può essere eseguita inoltre, nei casi selezionati per le conferme anche mediante sequenziamento automatizzato diretto Sanger, utlizzando il Sequenziatore 3500 GA (Thermo Fisher Scientific). La sensibilità analitica di questa metodica consente la visualizzazione delle varianti fino ad una frequenza allelica del 10-15% a seconda della mutazione.

• Analisi mediante Real-Time PCR

L’analisi delle principali mutazioni del gene EGFR può essere eseguita inoltre, per le conferme dei casi dubbi e/o nei casi urgenti anche mediante real-time PCR utilizzando il kit CE IVD Easy PGX Ready e relativo apparecchio EasyPGX qPCR instrument (Diatech Pharmacogenetic) e l’Easy PGX Software per l’analisi dei dati. La sensibilità analitica di questo kit consente la visualizzazione delle varianti fino ad una frequenza allelica che va dal 5% allo 0.5%, a seconda della mutazione che si sta analizzando.

Metodiche per lo studio dei Trascritti di Fusione

I test sono eseguiti principalmente su RNA di pazienti con tumore del polmone NSCLC, estratto da sezioni di tessuto tumorale fissato in formalina e incluso in paraffina (FFPE) in cui sia indicata la zona tumorale e la relativa percentuale di cellule tumorali presenti.

Le tecnologie utilizzate sono:

• Analisi NGS mediante il pannello Ion AmpliSeq RNA Fusion Lung Cancer Research Panel

Il sequenziamento NGS può essere utilizzato anche per la ricerca dei riarrangiamenti, in particolare presso il Laboratorio di Biologia Molecolare viene utilizzato il Pannello Ion AmpliSeq RNA Fusion Lung Cancer Research Pane (Thermo Fisher Scientific). È un test NGS che consente di ricercare e analizzare più di 70 trascritti di fusione relativi a quattro geni rilevanti nel tumore del polmone: ALK, ROS1, RET, NTRK1. Il pannello include anche 5 geni che fungono da controlli positivi.

L’analisi viene eseguita su RNA estratto da sezioni di tessuto tumorale fissato in formalina e incluso in paraffina (FFPE) mediante NGS su piattaforma Ion Torrent PGM o Ion Torrent S5 (Thermo Fisher Scientific). L'analisi dei dati è effettuata tramite le pipeline dei software Ion Reporter e Torrent Suite e la visualizzazione delle "reads" tramite IGV.

• Analisi mediante Real-Time PCR

L’analisi dei principali trascritti di fusione può essere eseguita inoltre, per le conferme dei casi dubbi e/o nei casi urgenti, anche mediante real-time PCR utilizzando il kit CE-IVD Easy PGX Ready ALK/ROS1/RET/MET e relativo apparecchio EasyPGX qPCR instrument (Diatech Pharmacogenetic) e l’Easy PGX Software per l’analisi dei dati.

Modulistica per la richiesta degli esami

Sul modulo MO_LabOncMed_190_Catalogo delle Prestazioni di Diagnostica Molecolare è possibile prendere visione dell’elenco delle prestazioni che sono eseguite presso il Laboratorio di Biologia Molecolare, il materiale su cui viene eseguita l’analisi, i tempi di refertazione e i moduli da compilare per la richiesta del test, che sono inoltre di seguito indicati.

Per la richiesta delle analisi molecolari, far riferimento alle istruzioni presenti nel MO_LabOncMed_191_Modulo di Istruzioni per la Richiesta delle Analisi Mutazionali.

Per la corretta compilazione della ricetta medica del Sistema Sanitario Nazionale (SSN) rossa o elettronica, è possibile consultare la tabella con i codici delle varie prestazioni da richiedere e le relative quantità, presenti nel modulo MO_LabOncMed_192_Ricetta SSN: Codici Prestazioni di Diagnostica Molecolare.

Unitamente alla ricetta SSN, per la richiesta dei singoli test, utilizzare il MO_LabOncMed_193_Modulo di Richiesta Analisi Molecolari.

Per tutti i pazienti è necessario che venga compilato, insieme al medico che richiede il test, il consenso informato MO_LabOncMed_194_Modulo Consenso_Informato.

Nel caso in cui l’analisi debba essere eseguita su tessuto tumorale conservato presso l’Anatomia Patologica dell’Ospedale di Perugia, per richiedere le sezioni è necessario compilare la delega MO_LabOncMed_195_Modulo delega Anatomia Patologica da inviare insieme alla carta d’identità del paziente.

2.  ESAMI PREDITTIVI DI RISPOSTA ALLA TERAPIA SU BIOPSIA LIQUIDA

Cosa si intende per Biopsia Liquida

Per biopsia liquida si intende l’analisi di biomarcatori tumorali mediante un prelievo di fluidi biologici (sangue, urine, liquor…) come surrogato del tessuto neoplastico, per ottenere informazioni utili ai fini diagnostici, prognostici o predittivi di risposta alla terapia.

L’analisi del ctDNA isolato dal plasma separato dal sangue periferico, rappresenta oggi la principale applicazione della biopsia liquida nella pratica clinica.

Applicazioni cliniche della biopisa liquida

Il principale campo di applicazione della biopsia liquida ad oggi è rappresentato dall’identificazione di fattori predittivi di risposta alla terapia in pazienti con malattia avanzata, in particolare per l’analisi mutazionale del gene EGFR in pazienti con NSCLC in stadio avanzato.

Esistono due diversi scenari clinici in cui questo test trova applicazione:

1. L’analisi mutazionale del gene EGFR in pazienti naïve con NSCLC avanzato al momento della DIAGNOSI

La determinazione dello stato mutazionale di EGFR per la scelta della migliore strategia terapeutica è attualmente raccomandata in tutti i pazienti selezionati con NSCLC avanzato. Nonostante il tessuto tumorale rappresenti il campione d’elezione su cui eseguire l’analisi, in circa il 20% dei casi non è disponibile o non è sufficiente per qualità e/o quantità per effettuare le analisi molecolari previste.

Nel 2014 l’EMA (European Medicines Agency), ha approvato l’utilizzo del ctDNA per la determinazione dello stato mutazionale di EGFR su biopsia liquida come possibile alternativa all’analisi su tessuto tumorale, in pazienti con NSCLC avanzato in cui la quantità/qualità del tessuto disponibile non siano sufficienti per eseguire il test.

2. L’analisi mutazionale del gene EGFR in pazienti con NSCLC avanzato al momento della PROGRESSIONE di malattia a EGFR-TKIs

L’approvazione e la rimborsabilità da parte di AIFA dell’inibitore di terza generazione di EGFR per il trattamento di pazienti con NSCLC localmente avanzato o metastatico, positivo per la mutazione T790M, rende necessaria la rivalutazione dello stato mutazionale del gene EGFR al momento della progressione radiologica dopo trattamento con EGFR-TKIs per definire la migliore strategia terapeutica.

A causa dell’inferiore sensibilità del test, nel caso di un risultato negativo, l’analisi deve essere ripetuta sul tessuto tumorale prelevato mediante re-biopsia.

Metodiche per lo studio delle alterazioni molecolari del ctDNA

Vista la scarsa quantità e la natura molto frammentata del ctDNA, la ricerca di biomarcatori di origine tumorale richiede metodiche dedicate e molto efficienti per l’estrazione e molto sensibili per la fase analitica. Tra le più utilizzate vi sono l’NGS, la Digital PCR e la Real-Time PCR.

• Analisi NGS mediante il pannello Oncomine™ Lung Cell‑Free Total Nucleic Acid Research

Presso il Laboratorio di Biologia Molecolare per l’analisi NGS su biopsia liquida, viene utilizzato il pannello NGS Oncomine™ Lung Cell‑Free Total Nucleic Acid Research (Thermo Fisher Scientific) che analizza il Total Nucleic Acid (TNA) estratto da plasma. Questo saggio prevede la ricerca di mutazioni su 12 geni (ALK, BRAF, EGFR, ERBB2, KRAS, MAP2K1, MET, NRAS, PIK3CA, RET, ROS1, TP53) valutati per specifiche regioni target potenzialmente associati allo sviluppo neoplastico, l’analisi di trascritti di fusione relativi a 3 geni rilevanti nel tumore del polmone (ALK, ROS1, RET, per un totale di 49 fusioni) e lo studio del Copy Number Variation (CNV) e dello skipping dell’esone 14 del gene MET, con una LOD (Limite di Determinazione) che può arrivare allo 0.05% di frequenza allelica, una sensibilità di circa 90% e una specificità maggiore del 99%.

Il sequenziamento NGS viene eseguito su piattaforma Ion Torrent PGM o S5 (Thermo Fisher Scientific), l'analisi dei dati viene effettuata tramite le pipeline dei software Ion Reporter e Torrent Suite, per la visualizzazione delle "reads" viene utilizzato IGV (Integrative Genomics Viewer), l’allineamento e chiamata delle varianti viene fatto rispetto al genoma di riferimento hg19.

• Digital PCR

L’analisi delle principali mutazioni driver e di resistenza del gene EGFR (delezioni dell’esone 19, T790M e L858R) su DNA plasmatico (ctDNA), può essere eseguita inoltre, nei casi urgenti o per le conferme dei casi dubbi, anche mediante Digital PCR utilizzando sonde TaqMan (Thermo Fisher Scientific) e la piattaforma QuantStudio 3D Digital PCR System (Thermo Fisher Scientific).

La Digital PCR (dPCR) è una PCR end-point che fornisce un dato mutazionale sia qualitativo che quantitativo (in copie/μL) e presenta un elevato livello di sensibilità (LOD fino allo 0,01% di frequenza allelica).

Modulistica per la richiesta degli esami

Sul modulo MO_LabOncMed_190_Catalogo delle Prestazioni di Diagnostica Molecolare è possibile prendere visione dell’elenco delle prestazioni che vengono eseguite presso il Laboratorio di Biologia Molecolare, il materiale su cui viene eseguita l’analisi, i tempi di refertazione e i moduli da compilare per la richiesta del test, che sono inoltre di seguito indicati.

Per la richiesta delle analisi molecolari, far riferimento alle istruzioni presenti nel MO_LabOncMed_191_Modulo di Istruzioni per la Richiesta delle Analisi Mutazionali.

Per la corretta compilazione della ricetta medica del Sistema Sanitario Nazionale (SSN) rossa o elettronica, è possibile consultare la tabella con i codici delle varie prestazioni da richiedere e le relative quantità, presenti nel modulo MO_LabOncMed_192_Ricetta SSN: Codici Prestazioni di Diagnostica Molecolare.

Unitamente alla ricetta SSN, per la richiesta dei singoli test, utilizzare il MO_LabOncMed_193_Modulo di Richiesta Analisi Molecolari

Per tutti i pazienti è necessario che venga compilato, insieme al medico che richiede il test, il consenso informato MO_LabOncMed_194_Modulo Consenso_Informato.

Cosa si intende per Farmacogenetica

La FARMACOGENETICA si propone di studiare le basi genetiche e in particolare le modificazioni di sequenza del DNA (le cosiddette “varianti polimorfiche” o “polimorfismi”) responsabili della variabilità interindividuale di risposta agli agenti farmacologici. L’identificazione delle varianti polimorfiche presenti nei geni codificanti gli enzimi, i recettori e le altre proteine coinvolte nella risposta farmacologica e la comprensione delle conseguenze fenotipiche ad esse associate, faciliterà la scelta del farmaco più appropriato per ogni paziente e consentirà di ridurre enormemente, fino ad evitare, la tossicità ed il fallimento terapeutico.

Applicazioni cliniche della Farmacogenetica

Presso il Laboratorio di Biologia Molecolare si svolgono principalmente due tipologie di analisi farmacogenetiche:

1. Analisi dei polimorfismi del gene DPYD

L’analisi molecolare del gene DPYD è importante ai fini della valutazione dell’eventuale tossicità alle fluoropirimidine (5-FU, capecitabina). Nonostante il trattamento con fluoropirimidine sia generalmente ben tollerato, in alcuni pazienti è stata riportata una tossicità grave e in alcuni casi letale.

Il gene DPYD codifica per il principale enzima coinvolto nel catabolismo delle fluoropirimidine, la diidropirimidina deidrogenasi (DPD). L’eventuale presenza di varianti alleliche su questo gene può pertanto essere associata a ridotta attività enzimatica, questo si traduce principalmente in un deficit della clearance del farmaco che può determinare gravi tossicità gastrointestinali ed ematologiche.

A chi è rivolto il test

L’analisi farmacogenetica DPYD è raccomandabile:

1. prima della terapia con fluoropirimidine ogni qualvolta, a giudizio dell’oncologo, il trattamento venga proposto ad un paziente con caratteristiche cliniche (comorbidità, performance status (PS), stadio di malattia) che lascino supporre un limitato impatto in termini di sopravvivenza e/o risposta e/o sia elevato il rapporto rischio/beneficio. L’analisi deve comprendere le mutazioni: c.1236G>A (c.1129–5923C>G), c.1679T>G, c.1905+1G>A e c.2846A>T;
2. nei casi di tossicità gravi o inattese comparse durante la terapia con fluoropirimidine è consigliata l’analisi delle mutazioni c.1236G>A, c.1679T>G, c.1905+1G>A, c.2846A>T e c.2194G>A qualora il paziente non le abbia precedentemente eseguite.

Come viene eseguito il test del DPYD

L’analisi molecolare viene effettuata su DNA germinale estratto da sangue periferico raccolto in una provetta con anticoagulante (EDTA).

Il test viene eseguito mediante l’utilizzo del kit CE-IVD Easy PGX Ready DPYD e relativo apparecchio EasyPGX qPCR instrument (Diatech Pharmacogenetic) e l’analisi viene eseguita utilizzando l’Easy PGX Software.

 2. Analisi dei polimorfismi del gene UGT1A1

L’analisi molecolare del gene UGT1A1 è importante ai fini della valutazione dell’eventuale tossicità alla chemioterapia con irinotecano.

Il gene UGT1A1 infatti codifica per il principale enzima coinvolto nel catabolismo dell’irinotecano, la uridina glucuronosiltransferasi isoforma 1A1 (UGT1A1). L’irinotecano può provocare grave tossicità gastrointestinale ed ematologica derivante dal deficit del suo metabolismo di coniugazione con acido glucuronico dipendente dall’enzima UGT1A1. Il gene UGT1A1 presenta una variante allelica principale della regione promoter ([TA]7TAA, UGT1A1*28, rs8175347, con ripetizioni di 7 TA) associata a bassa attività trascrizionale e ridotta attività enzimatica. Questo determina principalmente deficit di clearance che possono causare gravi tossicità gastrointestinali ed ematologiche, in particolare nei soggetti con genotipo omozigote mutato, che rende necessario ridurre il dosaggio iniziale dell’irinotecano almeno del 30% al fine di evitare i suddetti effetti di tossicità.

A chi è rivolto il test

Al fine di prevenire reazioni avverse potenzialmente molto gravi, l’analisi farmacogenetica UGT1A1 è raccomandabile:

1. prima della terapia con irinotecano ogni qualvolta, a giudizio dell’oncologo, il trattamento venga proposto ad un paziente con caratteristiche cliniche (comorbidità, PS, stadio di malattia) che lascino supporre un limitato impatto in termini di sopravvivenza e/o risposta e/o sia elevato il rapporto rischio/beneficio;
2. durante la terapia con irinotecano nei casi di tossicità gastrointestinale di grado ≥3 e/o ematologica di grado 4 e comunque in tutti i casi di tossicità gravi inattese.

Come viene eseguito il test dell’UGT1A1

L’analisi molecolare viene effettuata su DNA germinale estratto da sangue periferico raccolto in una provetta con anticoagulante (EDTA).

Il test viene eseguito mediante l’utilizzo del kit CE-IVD Easy PGX Ready UGT1A1 e relativo apparecchio EasyPGX qPCR instrument (Diatech Pharmacogenetic) e l’analisi viene eseguita utilizzando l’Easy PGX Software.

Modulistica per la richiesta degli esami

Sul modulo MO_LabOncMed_190_Catalogo delle Prestazioni di Diagnostica Molecolare è possibile prendere visione dell’elenco delle prestazioni che vengono eseguite presso il Laboratorio di Biologia Molecolare, il materiale su cui viene eseguita l’analisi, i tempi di refertazione e i moduli da compilare per la richiesta del test, che sono inoltre di seguito indicati.

Per la richiesta delle analisi molecolari, far riferimento alle istruzioni presenti nel MO_LabOncMed_191_Modulo di Istruzioni per la Richiesta delle Analisi Mutazionali.

Per la corretta compilazione della ricetta medica del Sistema Sanitario Nazionale (SSN) rossa o elettronica, è possibile consultare la tabella con i codici delle varie prestazioni da richiedere e le relative quantità, presenti nel modulo MO_LabOncMed_192_Ricetta SSN: Codici Prestazioni di Diagnostica Molecolare.

Unitamente alla ricetta SSN, per la richiesta dei singoli test, utilizzare il MO_LabOncMed_193_Modulo di Richiesta Analisi Molecolari

Per tutti i pazienti è necessario che venga compilato, insieme al medico che richiede il test, il consenso informato MO_LabOncMed_194_Modulo Consenso_Informato.

Cosa si intende per Analisi dell’Instabilità dei Microsatelliti (MSI)

I microsatelliti sono brevi sequenze di DNA ripetute da 15 a 30 volte e disperse nel genoma umano. Proprio per la loro natura, sono maggiormente esposti a variazioni della loro lunghezza durante la replicazione. Il mancato funzionamento del sistema di riparazione del MisMatch Repair (MMR) impedisce la correzione di questi errori favorendo l’instabilità delle sequenze microsatellite. Pertanto, l’instabilità dei microsatelliti (microsatellite instabiity, MSI) può essere considerata come un marcatore del mancato funzionamento del sistema di riparazione del MMR presente in diversi tipi di tumori, tra i quali i più rappresentati sono il tumore del colon, dell’endometrio ed i tumori gastrici. La MSI rappresenta la principale alterazione genetica (~90-95%) nella sindrome di Lynch (o cancro colon-rettale ereditario non poliposico, HNPCC) ed è riscontrata nel 15% dei tumori colon-rettali sporadici.

Applicazioni cliniche dell’Instabilità dei Microsatelliti

Gli scenari clinici in cui viene richiesta l’analisi dell’instabilità dei microsatelliti (MSI) sono principalmente due:

1. come test di screening in tutti i pazienti con sospetta Sindrome di Lynch per identificare un deficit del MMR che la caratterizza (Vedi anche TEST GENETICI-Test genetici per la predisposizione al cancro).
2. nei pazienti con carcinoma del colon-retto (CRC) in stadio II, come ausilio nella decisione della somministrazione o meno della terapia adiuvante, vista la prognosi estremamente favorevole di questi pazienti.

In base all’analisi della MSI, il CRC può essere distinto in due diverse categorie: tumori con MMR difettivo e con alti livelli di instabilità dei microsatelliti (MSI-H, circa il 15%) e tumori con MMR funzionante e con bassi livelli di MSI (MSI-L, circa l’85%). I CRC MSH-H sono associati ad un elevato tasso di mutazione, infiltrazione di cellule immunitarie e prognosi migliore rispetto ai tumori con MSI basso o assente.

NOTA: Uno scenario emergente, ma non ancora approvato in Europa, è quello riguardante l’analisi della MSI, in diversi tipi istologici di tumore, come fattore predittivo di risposta all’immunoterapia, in particolare alla terapia con inibitori di PD-1/PD-L1.

Come viene eseguito il test

Il test viene eseguito su DNA estratto da sezioni di tessuto tumorale fissato in formalina e incluso in paraffina (FFPE), in cui sia indicata la zona tumorale e la relativa percentuale di cellule tumorali presenti, mediante l’utilizzo del kit CE-IVD Easy PGX Ready MSI e relativo apparecchio EasyPGX qPCR instrument (Diatech Pharmacogenetic).

Questo kit consente il rilevamento di 8 marcatori “quasi-monomorfici” mononucleotidici: BAT-25, BAT-26, NR-21, NR-22, NR-24, NR-27, CAT-25 e MONO-27 mediante PCR Real Time e successiva analisi dei target mediante l’utilizzo del Easy PGX Software.

Talvolta potrebbe essere necessario anche il DNA estratto da sangue periferico raccolto in una provetta con anticoagulante (EDTA).

Modulistica per la richiesta degli esami

Sul modulo MO_LabOncMed_190_Catalogo delle Prestazioni di Diagnostica Molecolare è possibile prendere visione dell’elenco delle prestazioni che vengono eseguite presso il Laboratorio di Biologia Molecolare, il materiale su cui viene eseguita l’analisi, i tempi di refertazione e i moduli da compilare per la richiesta del test, che sono inoltre di seguito indicati.

Per la richiesta delle analisi molecolari, far riferimento alle istruzioni presenti nel MO_LabOncMed_191_Modulo di Istruzioni per la Richiesta delle Analisi Mutazionali.

Per la corretta compilazione della ricetta medica del Sistema Sanitario Nazionale (SSN) rossa o elettronica, è possibile consultare la tabella con i codici delle varie prestazioni da richiedere e le relative quantità, presenti nel modulo MO_LabOncMed_192_Ricetta SSN: Codici Prestazioni di Diagnostica Molecolare.

Unitamente alla ricetta SSN, per la richiesta dei singoli test, utilizzare il MO_LabOncMed_193_Modulo di Richiesta Analisi Molecolari

Per tutti i pazienti è necessario che venga compilato, insieme al medico che richiede il test, il consenso informato MO_LabOncMed_194_Modulo Consenso_Informato.

Nel caso in cui l’analisi debba essere eseguita su tessuto tumorale conservato presso l’Anatomia Patologica dell’Ospedale di Perugia, per richiedere le sezioni è necessario compilare la richiesta per l’Anatomia Patologica MO_AnaPAtCitIst_31_Modulo Richiesta Preparati Istologici Anatomia Patologica e  la delega Modulo delega AP  da inviare insieme alla carta d’identità del paziente.(vedi MO_LabOncMed_191_Modulo di Istruzioni per la Richiesta delle Analisi Mutazionali ).

La Genetica Clinica Oncologica (GCO) si occupa dello studio dei geni responsabili di alcune forme non rare di tumori ereditari quali il tumore ereditario del colon-retto non associato a poliposi (o sindrome di Lynch) ed il tumore ereditario della mammella e dell’ovaio. A oggi, le alterazioni genetiche associate ad un aumentato rischio ereditario di tumore sono: BRCA1 e BRCA2 per le neoplasie della mammella e dell’ovaio e MHL1, MSH2, MSH6, PMS2, APC e MUTYH per i tumori ereditari del colon-retto. Recentemente è stata definita una rara forma di cancro gastrico diffuso ereditario, legata a mutazioni germinali del gene CDH1 che conferiscono un aumentato rischio di sviluppare non solo questo particolare tipo di carcinoma gastrico ma anche, nelle donne, il carcinoma lobulare della mammella.

BRCA1 e BRCA2, due geni oncosoppressori, codificano per proteine coinvolte nella riparazione e nella ricombinazione del DNA, nel controllo del ciclo cellulare e nella trascrizione. Le mutazioni nei geni BRCA1 e BRCA2 possono essere ereditate secondo un modello autosomico dominante, oppure insorgere de novo e sono associate ad un aumentato rischio di sviluppare tumore della mammella o dell'ovaio.

Recenti studi hanno riportato che le mutazioni ereditarie dei geni BRCA1 o BRCA2 aumentano sensibilmente il rischio di tumori alla prostata, di tumori al colon, ma anche di tumori al pancreas, alle tube di Falloppio e di melanoma.

Inoltre, è stato dimostrato che mutazioni dei geni BRCA1 e BRCA2, costituzionali o somatiche, rappresentano un biomarcatore predittivo di sensibilità al trattamento con inibitori del Poli(ADPribosio) Polimerasi (PARP), enzima coinvolto nei meccanismi cellulari di riparazione del danno a carico del DNA, nelle pazienti affette da carcinoma dell'ovaio in fase avanzata.

Gli individui che possono essere sottoposti a tali test sono essenzialmente tutti coloro per i quali si evidenzia una predisposizione ereditaria allo sviluppo di determinate neoplasie. Il test BRCA viene generalmente eseguito in primo luogo in pazienti con tumore della mammella o dell’ovaio che presentino caratteristiche cliniche e/o familiari sospette per una variante patogenica (VP) di BRCA.

Analisi di BRCA1-2 nel carcinoma della mammella

Per quanto riguarda il carcinoma mammario, l’analisi del BRCA1-2 viene eseguita principalmente con lo scopo di valutare l’eventuale predisposizione ereditaria allo sviluppo di tumori.

I/le pazienti (donne sane o donne e uomini già con una diagnosi di carcinoma mammario) che rispondano a determinati requisiti clinici e/o familiari, vengono indirizzati verso una consulenza genetica con lo scopo di stabilire se il/la paziente possa essere o meno candidabile al test BRCA.

A chi è rivolto il test

I criteri per l’invio alla consulenza genetica oncologica, secondo le linee guida AIOM 2019 sono:

• Storia personale di:

- Carcinoma mammario maschile

- Donna con carcinoma mammario e carcinoma ovarico;

- Donna con carcinoma mammario < 36 anni

- Donna con carcinoma mammario triplo negativo < 60 anni;

- Donna con carcinoma mammario bilaterale < 50 anni;

• Storia personale di carcinoma mammario < 50 anni e familiarità di primo grado per:

- Carcinoma mammario < 50 anni;

- Carcinoma ovarico non mucinoso o borderline a qualsiasi età;

- Carcinoma mammario bilaterale;

- Carcinoma mammario maschile;

• Storia personale di carcinoma mammario > 50 anni e familiarità per carcinoma mammario, ovarico in 2 o più parenti in primo grado* tra loro (di cui uno in primo grado con lei)
• Storia familiare di:

Variante patogenetica nota in un gene predisponente in un familiare.

Tramite opportuni software viene fatto un calcolo del rischio e soltanto i/le pazienti che presentano una probabilità superiore al 10% di identificare una VP BRCA germinale, avranno l’indicazione all’esecuzione del test.

La consulenza genetica

Consiste in un colloquio durante il quale si ricostruisce la storia familiare e personale mediante l'albero genealogico per identificare eventuali situazioni di rischio genetico di tumore della mammella, dell’ovaio, ma anche di altri organi.

Risultati del test

Il test viene eseguito su DNA germinale estratto da sangue periferico raccolto in due provette con anticoagulante (EDTA).

Quando il risultato del test BRCA è informativo, cioè viene identificata una variante patogenetica o probabilmente patogenetica, il test genetico mirato (cioè la ricerca della variante familiare) può essere esteso agli altri membri della famiglia che desiderino effettuarlo, a partire dai 18 anni di età (la probabilità di aver ereditato la variante è del 50% per ogni figlio di un individuo portatore di VP BRCA). La presenza di una VP BRCA individua donne sane che sono ad alto rischio di sviluppare carcinoma mammario e ovarico oppure, nel caso di donne già con una diagnosi di carcinoma mammario, quelle donne ad alto rischio di sviluppare un altro tumore primitivo mammario o ovarico.

Le strategie di riduzione del rischio

Le strategie di riduzione del rischio in donne sane portatrici di VP BRCA, prevedono un programma di sorveglianza clinico-strumentale personalizzato e la valutazione di una chirurgia di riduzione del rischio, i cui rischi e benefici vanno

discussi con la paziente (consulenza oncogenetica post-test).

Analisi di BRCA1-2 nel carcinoma ovarico

Per quanto riguarda i carcinomi dell’ovaio, due sono le possibili applicazioni del test BRCA: come test di predisposizione ereditaria allo sviluppo di tumori e come test predittivo di efficacia alle terapie antitumorali.

1. Il test per la predisposizione ereditaria allo sviluppo di tumori è consigliato alla diagnosi a tutte le pazienti con carcinoma ovarico non mucinoso e non borderline, carcinoma delle tube di Falloppio o carcinoma peritoneale primitivo.

L’eventuale identificazione di una variante patogenetica germinale nei geni BRCA permette di intraprendere un percorso di consulenza oncogenetica nei familiari al fine di identificare i portatori ad alto rischio, cui proporre programmi mirati (sorveglianza clinico-strumentale) di diagnosi precoce dei tumori associati alle sindromi a trasmissione eredo-familiare BRCA-relate e strategie finalizzate alla riduzione del rischio (chirurgia preventiva).

1. Un’ulteriore, importante applicazione del test BRCA riguarda il suo utilizzo come test predittivo di efficacia alle terapie antitumorali e in particolare agli inibitori dell’enzima Poli (ADP-ribosio)Polimerasi (PARP).

Le varianti patogenetiche (VP) dei geni BRCA, siano esse di natura germinale o somatica, rappresentano un biomarcatore predittivo di maggiore sensibilità al trattamento con inibitori di PARP.

Studi retrospettivi suggeriscono inoltre che le pazienti affette da carcinoma ovarico portatrici di una variante patogenica ereditaria BRCA presentano una prognosi significativamente più favorevole, predittiva di sensibilità farmacologica a combinazioni terapeutiche contenenti derivati del platino.

In entrambi gli scenari è preferibile eseguire il test in prima istanza su DNA estratto da tessuto tumorale in modo da poter evidenziare sia le varianti germinali e quindi ereditarie che quelle somatiche e in caso di risultato positivo, ricercare la variante anche sul DNA estratto da sangue periferico (raccolto in due provette con anticoagulante (EDTA)) per individuare la natura dell’alterazione (somatica o germinale).

Analisi del BRCA1-2 nell’adenocarcinoma del pancreas metastatico

Per quanto riguarda i pazienti con adenocarcinoma del pancreas metastatico, due sono le possibili applicazioni del test BRCA: come test di predisposizione ereditaria allo sviluppo di tumori (pancreas, mammella, ovaio e prostata) e come test predittivo di efficacia alle terapie antitumorali.

1. Come test di predisposizione ereditaria allo sviluppo di tumori, la presenza di una variante patogenica (VP) del gene BRCA in questi pazienti consente ai loro familiari sani l’accesso alla consulenza genetico-oncologica e al test preventivo per la ricerca mirata della VP familiare.

Nel caso di esito positivo, saranno avviati a percorsi di prevenzione primaria (farmacoprevenzione, mastectomia e salpingo-ovariectomia) e secondaria (sorveglianza clinico-strumentale) per la riduzione del rischio di carcinoma mammario e ovario, mentre non esistono ad oggi percorsi definiti di prevenzione del carcinoma pancreatico.

1. È inoltre indicato eseguire il test BRCA come test predittivo di efficacia alle terapie antitumorali nei pazienti con adenocarcinoma pancreatico metastatico al momento della diagnosi, giudicati clinicamente in grado di poter tollerare una prima linea contenente un derivato del platino.

Nel caso in cui il paziente risultasse portatore di variante patogenetica di BRCA, il paziente dovrebbe essere candidato ad una terapia antitumorale di prima linea contenente un derivato del platino al fine di poter poi offrire, ai pazienti non in progressione, di mantenimento.

In entrambi gli scenari, il test dovrebbe essere effettuato su DNA estratto da sangue periferico raccolto in due provette con anticoagulante (EDTA).

Come viene eseguito il test

L’analisi di sequenza della porzione codificante dei geni BRCA1 e BRCA2 (esoni e giunzioni esoni/introni) permette di individuare piccole variazioni della sequenza del DNA (singoli cambiamenti nucleotidici, inserzioni/delezioni da poche paia a qualche decina di basi) e consente di identificare circa il 90% delle VP a carico di questi geni. A completamento, deve essere eseguita la ricerca di ampi riarrangiamenti genici (es. delezioni di uno o più esoni o dell’intero gene, circa il 10%). L’analisi presso il nostro centro viene effettuata mediante tecnologia Next-Generation Sequencing (NGS) e/o mediante sequenziamento automatizzato diretto Sanger.

Il pannello NGS utilizzato è il Myriapod NGS-IL BRCA 1-2 panel (Diatech Pharmacogenetic) che prevede la preparazione di librerie NGS compatibili con la piattaforma Illumina MiSeq e l’analisi dei dati mediante il software Myriapod NGS Data Analysis, per la ricerca di mutazioni dei geni BRCA1, BRCA2 e PALB2 correlate con la predisposizione genetica al tumore alla mammella e all’ovaio. Il pannello permette di ottenere 302 ampliconi che coprono l'intera sequenza dei geni BRCA1 e BRCA2 e tutti gli esoni codificanti e regioni 5’ e 3’ UTR del gene PALB2. Il pannello include quindi anche l’analisi mutazionale di PALB2, gene che se mutato innalza il rischio di tumore alla mammella di circa dieci volte rispetto alla media.

La tecnologia NGS ha il vantaggio di consentire la rilevazione di un numero molto ampio di mutazioni, anche in geni diversi, anche quando presenti ad una bassa frequenza allelica.

Le analisi mediante metodiche NGS permettono inoltre di predire con un certo grado di affidabilità eventuali ampi riarrangiamenti sbilanciati in BRCA1/2, che possono essere anche individuati e confermati mediante altre metodiche quali la Multiplex Ligation Probe dependent Amplification (MLPA) o la Multiplex Amplicon Quantification (MAQ).

Il test può essere eseguito, a seconda dell’indicazione, su DNA estratto da sangue periferico raccolto in due provette con anticoagulante (EDTA) e/o su DNA estratto da sezioni di tessuto tumorale fissato in formalina e incluso in paraffina (FFPE). In quest’ultimo caso è necessario che sia indicata la percentuale di cellule tumorali presenti.

Interpretazioni delle varianti genetiche BRCA identificate

Per le interpretazioni delle varianti genetiche BRCA identificate vengono utilizzati i criteri sviluppati dall’Evidence-based Network for the Interpretation of Germline Mutant Alleles (ENIGMA) e dall’American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG).

Questi criteri definiscono il significato delle varianti dei geni BRCA come predittivi di rischio ereditario e non sono indicativi in merito alla risposta alle terapie.

Le varianti sono divise in cinque categorie (Classe 1-5), secondo le indicazioni IARC in: benigna (Classe 1), probabilmente benigna (Classe 2), di incerto significato (Classe 3), probabilmente patogenetica (Classe 4) e patogenetica (Classe 5).

Modulistica per la richiesta del test BRCA1-2 su sangue e/o tessuto tumorale

Sul MO_LabOncMed_196_Catalogo delle Prestazioni Counselling Genetico è possibile prendere visione dell’elenco delle prestazioni dei test genetici che vengono eseguiti presso il Laboratorio di Biologia Molecolare, il materiale su cui viene eseguita l’analisi, i tempi di refertazione e i moduli da compilare per la richiesta del test, che sono inoltre di seguito indicati.

Per la richiesta delle analisi molecolari, far riferimento alle istruzioni presenti nel MO_LabOncMed_191_Modulo di Istruzioni per la Richiesta delle Analisi Mutazionali.

Per la corretta compilazione della ricetta medica del Sistema Sanitario Nazionale (SSN) rossa o elettronica, è possibile consultare la tabella con i codici delle varie prestazioni da richiedere e le relative quantità, presenti nel modulo MO_LabOncMed_192_Ricetta SSN: Codici Prestazioni di Diagnostica Molecolare.

Unitamente alla ricetta SSN, per la richiesta dei singoli test, è possibile utilizzare il MO_LabOncMed_197_Modulo di Richiesta per Alterazioni Germinali

Per tutti i pazienti è necessario che venga compilato, insieme al medico che richiede il test, un questionario per il calcolo del rischio e il consenso informato MO_LabOncMed_44_Questionario_Cons_Informato_MAMMELLA_BRCA1-2, o MO_LabOncMed_126_Questionario_Cons_Informato OVAIO_BRCA1-2 ,diverso a seconda della patologia.

Nel caso in cui l’analisi debba essere eseguita su tessuto tumorale conservato presso l’Anatomia Patologica dell’Ospedale di Perugia, per richiedere le sezioni è necessario compilare la richiesta per l’Anatomia Patologica MO_AnaPAtCitIst_31_Modulo Richiesta Preparati Istologici Anatomia Patologica e  la delega Modulo delega AP  da inviare insieme alla carta d’identità del paziente.(vedi MO_LabOncMed_191_Modulo di Istruzioni per la Richiesta delle Analisi Mutazionali ).

A cosa serve

I test genetici consentono lo studio di specifici geni con lo scopo di valutare se esiste un rischio ereditario di sviluppare alcuni tipi di tumori. Una malattia genetica si può verificare se uno o più geni non funzionano e può essere ereditaria, cioè trasmissibile di generazione in generazione.

A chi è rivolto il test

All’interno del percorso diagnostico/terapeutico del paziente oncologico, i Medici Oncologi con esperienza in Genetica Oncologica, selezionano pazienti che rispondono a specifiche caratteristiche di storia familiare per neoplasie e che sono quindi candidabili per un test genetico.

Come viene eseguito il test

Dal sangue intero (o da altro campione biologico in caso di indisponibilità del prelievo ematico) viene estratto il DNA genomico necessario per l’analisi genetica. Il DNA viene analizzato attraverso tecniche di “Next-Generation Sequencing” (NGS) e analisi di riarrangiamenti genici (copy number variations, CNVs). Presso il Laboratorio di Biologia Molecolare il test viene eseguito utilizzando il Pannello Hereditary Cancer Solution (HCS) (Sophia Genetics) che permette di analizzare le regioni codificanti e le giunzioni di spicing di 27 geni clinicamente rilevanti, associati con il carcinoma dell’ovaio e della mammella, l’HNPCC e la sindrome poliposica intestinale. Il test viene eseguito sullo strumento MiSeq e le sequenze geniche ottenute vengono analizzate attraverso un’avanzata analisi bioinformatica mediante il software dedicato per determinare la presenza di eventuali varianti nei geni in esame.

Possibili risultati del test

1. Risultato informativo:

La variante causa della malattia viene identificata. In questo caso i risultati del test possono riguardare, oltre al soggetto che lo ha eseguito, anche gli altri componenti del nucleo familiare in quanto le anomalie genetiche possono essere ereditabili e/o trasmissibili. Se una variante precedentemente identificata in un individuo della famiglia, non viene identificata nel soggetto in analisi, il rischio per il soggetto di sviluppare la patologia in questione è assimilabile al rischio della popolazione generale.

2. Risultato non informativo:

 La variante causa della malattia non viene identificata. Questo non esclude la possibilità di essere portatori di una variante localizzata in una regione del genoma non investigata dall’esame. Pertanto non è utile proseguire l’indagine ad eventuali familiari.

 La variante identificata presenta un significato clinico non certo o determinabile in base alle attuali conoscenze medico-scientifiche. L’interpretazione delle varianti genetiche si basa sulle più recenti conoscenze disponibili al momento dell’analisi. Tale interpretazione potrebbe cambiare in futuro con l’acquisizione di nuove informazioni scientifiche e mediche sulla struttura del genoma ed influire sulla valutazione stessa della variante.

 La variante identificata non è associabile con certezza alla malattia. In questo caso l’esecuzione del test su eventuali familiari potrebbe essere utile per chiarirne il ruolo.

Il risultato dell’analisi viene quindi consegnato al Medico Genetista Oncologo che ha richiesto l’analisi molecolare. In caso di risposta positiva o dubbia, questo può proporre al paziente di coinvolgere altri familiari, allo scopo di identificare tutti i soggetti della famiglia con predisposizione ereditaria ai tumori.

Analisi dei Microsatelliti

Vedi: 4. Analisi dell’Instabilità dei Microsatelliti (MSI)

Modulistica per la richiesta del test BRCA1-2 su sangue e/o tessuto tumorale

Sul MO_LabOncMed_196_Catalogo delle Prestazioni Counselling Genetico è possibile prendere visione dell’elenco delle prestazioni dei test genetici che vengono eseguiti presso il Laboratorio di Biologia Molecolare, il materiale su cui viene eseguita l’analisi, i tempi di refertazione e i moduli da compilare per la richiesta del test, che sono inoltre di seguito indicati.

Per la richiesta delle analisi molecolari, far riferimento alle istruzioni presenti nel MO_LabOncMed_191_Modulo di Istruzioni per la Richiesta delle Analisi Mutazionali.

Per la corretta compilazione della ricetta medica del Sistema Sanitario Nazionale (SSN) rossa o elettronica, è possibile consultare la tabella con i codici delle varie prestazioni da richiedere e le relative quantità, presenti nel modulo MO_LabOncMed_192_Ricetta SSN: Codici Prestazioni di Diagnostica Molecolare.

Unitamente alla ricetta SSN, per la richiesta dei singoli test, è possibile utilizzare il MO_LabOncMed_197_Modulo di Richiesta per Alterazioni Germinali

Per tutti i pazienti è necessario che venga compilato, insieme al medico che richiede il test, il consenso informato MO_LabOncMed_158_Cons_Informato analisi genetiche allo sviluppo tumori.