Esami predittivi di risposta alla terapia

I tumori in fase di crescita avanzata, infiltranti e/o metastatizzanti, rappresentano una delle principali sfide della medicina moderna. Oltre ai classici approcci chemioterapici sono stati progressivamente sviluppati nuovi protocolli basati sull’uso di farmaci innovativi a bersaglio molecolare.

L’attività svolta dal Laboratorio di Biologia Molecolare nella caratterizzazione biologica delle neoplasie solide ha permesso di caratterizzare e classificare i tumori umani, al fine di applicare un trattamento specifico per ogni fenotipo, massimizzando l’indice terapeutico. I risultati ottenuti dallo studio delle mutazioni geniche nel Non Small-Cell Lung Cancer (NSCLC), nel carcinoma del colon-retto, nel tumore stromale gastrointestinale (GIST) e nel melanoma in stadio avanzato, hanno confermato che la strategia farmacogenetica può essere usata per una scelta razionale di terapie mirate per il singolo paziente.

Esami predittivi di risposta alla terapia

1. Esami predittivi di risposta alla terapia su Tessuto Tumorale
2. Esami predittivi di risposta alla terapia su Biopsia Liquida
3. Esami di Farmacogenetica
4. Analisi dell’Instabilità dei Microsatelliti (MSI) 

1. ESAMI PREDITTIVI DI RISPOSTA ALLA TERAPIA SU TESSUTO TUMORALE

A cosa serve

La caratterizzazione biomolecolare delle alterazioni geniche dei tumori e la complessa interazione tra le molecole dello stesso network rappresenta il fondamento su cui si basa l’oncologia di precisione. Il concetto di oncologia di precisione prevede la ricerca di specifiche alterazioni di una determinata sequenza genica, RNA o proteina che qualora presenti in un paziente con una specifica neoplasia, possano essere utilizzate come target di un trattamento individualizzato. Pertanto il paziente candidato al test viene selezionato sulla base delle caratteristiche molecolari del proprio tumore, per uno specifico trattamento target che gli consenta di giovare di un potenziale beneficio clinico maggiore e più duraturo rispetto alla terapia convenzionale, promuovendo così l'appropriatezza della terapia.

A chi è rivolta

L'attività del Laboratorio di Biologia Molecolare è rivolta a pazienti oncologici che necessitano di analisi diagnostiche finalizzate ad una personalizzazione delle terapie.

È svolta su richiesta dei medici oncologi e di altri specialisti, sia interni che esterni all'Azienda Ospedaliera di Perugia.

I tumori per i quali sono attualmente disponibili analisi biomolecolari per la risposta ai farmaci a target molecolare sono:

• Tumore del polmone (Non Small-Cell Lung Cancer-NSCLC): analisi mutazionale dei geni EGFR e KRAS, analisi dei trascritti di fusione ALK, ROS1

Tra le alterazioni molecolari più frequenti nel NSLC vi sono: le mutazioni del gene EGFR (10-15% dei pazienti caucasici), KRAS (20-30%), i riarrangiamenti di ALK (3-7%), ROS1 (1-2%), RET (1-2%) e NTRK (0.5-1%), le mutazioni del gene BRAF (2-4-%), ERBB2 (1-2%) e le amplificazioni o mutazioni del gene MET (2-4%). In Italia ad oggi sono approvati e rimborsati solo i farmaci inibitori delle tirosino-chinasi di EGFR, ALK e ROS1, le altre alterazioni possono essere utili ai fini dell’accesso a studi clinici o ai programmi di accesso allargato.

Tra le mutazioni di EGFR, sono state identificate mutazioni attivanti a carico degli esoni 18, 19, 20 e 21. Le più frequenti, anche definite come comuni o classiche, sono le delezioni dell’esone 19 (Ex19dels) e la mutazione puntiforme dell’esone 21 (L858R), che insieme rappresentano circa il 90% di tutte le mutazioni di EGFR riscontrate in questi pazienti. Gli inibitori tirosino-chinasici di EGFR (TKI) rappresentano il trattamento di I linea raccomandato nei pazienti con NSCLC avanzato e mutazioni classiche.

Altri marcatori molto importanti in questi pazienti ai fini della scelta del regime terapeutico più appropriato sono ALK e ROS1. La presenza del riarrangiamento identifica un sottogruppo di pazienti candidabili al trattamento con inibitori tirosino-chinasici di ALK.

• Tumore colon-retto: analisi mutazionale dei geni KRAS, NRAS e BRAF

Nel paziente con carcinoma del colon-retto metastatico, al momento di intraprendere un trattamento, per impostare una corretta programmazione terapeutica, deve essere effettuata la valutazione dello stato mutazionale dei geni KRAS (esoni 2, 3 e 4) e NRAS (esoni 2, 3 e 4). La presenza di mutazioni somatiche nei suddetti geni infatti, è un meccanismo di resistenza alla terapia con anticorpi monoclonali anti-EGFR.

Circa il 35% dei pazienti con tumore metastatico del colon-retto presentano mutazioni somatiche a carico del gene KRAS mentre il 3-5% di questi pazienti presentano mutazioni somatiche a carico del gene NRAS.

Pertanto EMA e AIFA hanno ristretto l’impiego di anticorpi monoclonali anti-EGFR ai soli pazienti RAS wild type.

Le mutazioni di BRAF invece sono presenti in circa il 10% dei pazienti con carcinoma del colon-retto, la mutazione più frequente è la V600E e la presenza di tale mutazione è associata ad una peggiore prognosi.

• Melanoma: analisi mutazionale del gene BRAF

Nel melanoma, il gene BRAF è mutato nel 45-50% dei casi; la mutazione più diffusa (85-90% dei casi) è rappresentata dalla sostituzione V600E. Le rimanenti mutazioni BRAF si verificano spesso sullo stesso codone: V600K (la più frequente <10% dei casi), V600D e V600R.

La mutazione BRAF-V600 ha oggi un significato prevalentemente predittivo nella gestione del paziente con melanoma, in quanto identifica una potenziale sensibilità al trattamento con la combinazione di BRAF e MEK inibitori.

• Tumore stromale gastrointestinale (GIST): analisi mutazionale del gene KIT

L’analisi degli esoni 9 e 11 del gene KIT è necessaria per selezionare la migliore strategia terapeutica nei pazienti con tumore stromale gastrointestinale (GIST) in stadio avanzato. Più del 80% dei GIST è caratterizzato da una mutazione specifica a carico del gene KIT, di queste circa il 65% è presente sull’esone 11. Tali mutazioni sono responsabili di un’attivazione costitutiva del recettore, che sembra rivestire un ruolo cardine nel processo di sviluppo di questi tumori. Lo stato mutazionale di KIT sembra essere predittivo della risposta clinica agli inibitori tirosin-chinasici di KIT.

Metodiche per lo studio delle alterazioni molecolari del DNA

I test sono effettuati su DNA di pazienti con tumore del polmone NSCLC, tumore del colon-retto e melanoma, estratto da sezioni di tessuto tumorale fissato in formalina e incluso in paraffina (FFPE), in cui sia indicata la zona tumorale e la relativa percentuale di cellule tumorali presenti.

Le tecnologie utilizzate sono:

• Analisi NGS mediante il pannello Ion AmpliSeq Colon and Lung Cancer Research Panel V2

Presso il Laboratorio di Biologia Molecolare viene utilizzato il Pannello Ion AmpliSeq Colon and Lung Cancer Research Panel V2 (Thermo Fisher Scientific) che prevede l'analisi molecolare per la ricerca di mutazioni in 22 geni (KRAS, EGFR, BRAF, PIK3CA, AKT1, ERBB2, PTEN, NRAS, STK11, MAP2K1, ALK, DDR2, CTNNB1, MET, TP53, SMAD4, FBXW7, FGFR3, NOTCH1, ERBB4, FGFR1, FGFR2) potenzialmente associati allo sviluppo neoplastico.

Il sequenziamento NGS viene eseguito su piattaforma Ion Torrent PGM o Ion Torrent S5 (Thermo Fisher Scientific), l'analisi dei dati viene effettuata tramite le pipeline dei software Ion Reporter e Torrent Suite, per la visualizzazione delle "reads" viene utilizzato IGV (Integrative Genomics Viewer), l’allineamento e la chiamata delle varianti viene fatto rispetto al genoma di riferimento hg19.

La sensibilità analitica del test consente la visualizzazione delle varianti fino ad una frequenza allelica del 3%.

• Analisi mediante sequenziamento automatizzato diretto

L’analisi dei principali esoni dei geni EGFR (esoni 18-19-20-21), KRAS (esoni 2-3-4), BRAF (esoni 11-15), MET (esoni 14-15), ERBB2 (esone 20), PIK3CA (esoni 10-21), KIT (esoni 9-11) può essere eseguita inoltre, nei casi selezionati per le conferme anche mediante sequenziamento automatizzato diretto Sanger, utlizzando il Sequenziatore 3500 GA (Thermo Fisher Scientific). La sensibilità analitica di questa metodica consente la visualizzazione delle varianti fino ad una frequenza allelica del 10-15% a seconda della mutazione.

• Analisi mediante Real-Time PCR

L’analisi delle principali mutazioni del gene EGFR può essere eseguita inoltre, per le conferme dei casi dubbi e/o nei casi urgenti anche mediante real-time PCR utilizzando il kit CE IVD Easy PGX Ready e relativo apparecchio EasyPGX qPCR instrument (Diatech Pharmacogenetic) e l’Easy PGX Software per l’analisi dei dati. La sensibilità analitica di questo kit consente la visualizzazione delle varianti fino ad una frequenza allelica che va dal 5% allo 0.5%, a seconda della mutazione che si sta analizzando.

Metodiche per lo studio dei Trascritti di Fusione

I test sono eseguiti principalmente su RNA di pazienti con tumore del polmone NSCLC, estratto da sezioni di tessuto tumorale fissato in formalina e incluso in paraffina (FFPE) in cui sia indicata la zona tumorale e la relativa percentuale di cellule tumorali presenti.

Le tecnologie utilizzate sono:

• Analisi NGS mediante il pannello Ion AmpliSeq RNA Fusion Lung Cancer Research Panel

Il sequenziamento NGS può essere utilizzato anche per la ricerca dei riarrangiamenti, in particolare presso il Laboratorio di Biologia Molecolare viene utilizzato il Pannello Ion AmpliSeq RNA Fusion Lung Cancer Research Pane (Thermo Fisher Scientific). È un test NGS che consente di ricercare e analizzare più di 70 trascritti di fusione relativi a quattro geni rilevanti nel tumore del polmone: ALK, ROS1, RET, NTRK1. Il pannello include anche 5 geni che fungono da controlli positivi.

L’analisi viene eseguita su RNA estratto da sezioni di tessuto tumorale fissato in formalina e incluso in paraffina (FFPE) mediante NGS su piattaforma Ion Torrent PGM o Ion Torrent S5 (Thermo Fisher Scientific). L'analisi dei dati è effettuata tramite le pipeline dei software Ion Reporter e Torrent Suite e la visualizzazione delle "reads" tramite IGV.

• Analisi mediante Real-Time PCR

L’analisi dei principali trascritti di fusione può essere eseguita inoltre, per le conferme dei casi dubbi e/o nei casi urgenti, anche mediante real-time PCR utilizzando il kit CE-IVD Easy PGX Ready ALK/ROS1/RET/MET e relativo apparecchio EasyPGX qPCR instrument (Diatech Pharmacogenetic) e l’Easy PGX Software per l’analisi dei dati.

Modulistica per la richiesta degli esami

Sul modulo MO_LabOncMed_165_Catalogo delle Prestazioni di Diagnostica Molecolare è possibile prendere visione dell’elenco delle prestazioni che sono eseguite presso il Laboratorio di Biologia Molecolare, il materiale su cui viene eseguita l’analisi, i tempi di refertazione e i moduli da compilare per la richiesta del test, che sono inoltre di seguito indicati.

Per la richiesta delle analisi molecolari, far riferimento alle istruzioni presenti nel MO_LabOncMed_166_Modulo di Istruzioni per la Richiesta delle Analisi Mutazionali.

Per la corretta compilazione della ricetta medica del Sistema Sanitario Nazionale (SSN) rossa o elettronica, è possibile consultare la tabella con i codici delle varie prestazioni da richiedere e le relative quantità, presenti nel modulo MO_LabOncMed_167_Ricetta SSN: Codici Prestazioni di Diagnostica Molecolare.

Unitamente alla ricetta SSN, per la richiesta dei singoli test, utilizzare il MO_LabOncMed_168_Modulo di Richiesta Analisi Molecolari.

Per tutti i pazienti è necessario che venga compilato, insieme al medico che richiede il test, il consenso informato MO_LabOncMed_Consenso_Informato.

Nel caso in cui l’analisi debba essere eseguita su tessuto tumorale conservato presso l’Anatomia Patologica dell’Ospedale di Perugia, per richiedere le sezioni è necessario compilare la delega Modulo delega AP da inviare insieme alla carta d’identità del paziente.

2.  ESAMI PREDITTIVI DI RISPOSTA ALLA TERAPIA SU BIOPSIA LIQUIDA

Cosa si intende per Biopsia Liquida

Per biopsia liquida si intende l’analisi di biomarcatori tumorali mediante un prelievo di fluidi biologici (sangue, urine, liquor…) come surrogato del tessuto neoplastico, per ottenere informazioni utili ai fini diagnostici, prognostici o predittivi di risposta alla terapia.

L’analisi del ctDNA isolato dal plasma separato dal sangue periferico, rappresenta oggi la principale applicazione della biopsia liquida nella pratica clinica.

Applicazioni cliniche della biopisa liquida

Il principale campo di applicazione della biopsia liquida ad oggi è rappresentato dall’identificazione di fattori predittivi di risposta alla terapia in pazienti con malattia avanzata, in particolare per l’analisi mutazionale del gene EGFR in pazienti con NSCLC in stadio avanzato.

Esistono due diversi scenari clinici in cui questo test trova applicazione:

1. L’analisi mutazionale del gene EGFR in pazienti naïve con NSCLC avanzato al momento della DIAGNOSI

La determinazione dello stato mutazionale di EGFR per la scelta della migliore strategia terapeutica è attualmente raccomandata in tutti i pazienti selezionati con NSCLC avanzato. Nonostante il tessuto tumorale rappresenti il campione d’elezione su cui eseguire l’analisi, in circa il 20% dei casi non è disponibile o non è sufficiente per qualità e/o quantità per effettuare le analisi molecolari previste.

Nel 2014 l’EMA (European Medicines Agency), ha approvato l’utilizzo del ctDNA per la determinazione dello stato mutazionale di EGFR su biopsia liquida come possibile alternativa all’analisi su tessuto tumorale, in pazienti con NSCLC avanzato in cui la quantità/qualità del tessuto disponibile non siano sufficienti per eseguire il test.

2. L’analisi mutazionale del gene EGFR in pazienti con NSCLC avanzato al momento della PROGRESSIONE di malattia a EGFR-TKIs

L’approvazione e la rimborsabilità da parte di AIFA dell’inibitore di terza generazione di EGFR per il trattamento di pazienti con NSCLC localmente avanzato o metastatico, positivo per la mutazione T790M, rende necessaria la rivalutazione dello stato mutazionale del gene EGFR al momento della progressione radiologica dopo trattamento con EGFR-TKIs per definire la migliore strategia terapeutica.

A causa dell’inferiore sensibilità del test, nel caso di un risultato negativo, l’analisi deve essere ripetuta sul tessuto tumorale prelevato mediante re-biopsia.

Metodiche per lo studio delle alterazioni molecolari del ctDNA

Vista la scarsa quantità e la natura molto frammentata del ctDNA, la ricerca di biomarcatori di origine tumorale richiede metodiche dedicate e molto efficienti per l’estrazione e molto sensibili per la fase analitica. Tra le più utilizzate vi sono l’NGS, la Digital PCR e la Real-Time PCR.

• Analisi NGS mediante il pannello Oncomine™ Lung Cell‑Free Total Nucleic Acid Research

Presso il Laboratorio di Biologia Molecolare per l’analisi NGS su biopsia liquida, viene utilizzato il pannello NGS Oncomine™ Lung Cell‑Free Total Nucleic Acid Research (Thermo Fisher Scientific) che analizza il Total Nucleic Acid (TNA) estratto da plasma. Questo saggio prevede la ricerca di mutazioni su 12 geni (ALK, BRAF, EGFR, ERBB2, KRAS, MAP2K1, MET, NRAS, PIK3CA, RET, ROS1, TP53) valutati per specifiche regioni target potenzialmente associati allo sviluppo neoplastico, l’analisi di trascritti di fusione relativi a 3 geni rilevanti nel tumore del polmone (ALK, ROS1, RET, per un totale di 49 fusioni) e lo studio del Copy Number Variation (CNV) e dello skipping dell’esone 14 del gene MET, con una LOD (Limite di Determinazione) che può arrivare allo 0.05% di frequenza allelica, una sensibilità di circa 90% e una specificità maggiore del 99%.

Il sequenziamento NGS viene eseguito su piattaforma Ion Torrent PGM o S5 (Thermo Fisher Scientific), l'analisi dei dati viene effettuata tramite le pipeline dei software Ion Reporter e Torrent Suite, per la visualizzazione delle "reads" viene utilizzato IGV (Integrative Genomics Viewer), l’allineamento e chiamata delle varianti viene fatto rispetto al genoma di riferimento hg19.

• Digital PCR

L’analisi delle principali mutazioni driver e di resistenza del gene EGFR (delezioni dell’esone 19, T790M e L858R) su DNA plasmatico (ctDNA), può essere eseguita inoltre, nei casi urgenti o per le conferme dei casi dubbi, anche mediante Digital PCR utilizzando sonde TaqMan (Thermo Fisher Scientific) e la piattaforma QuantStudio 3D Digital PCR System (Thermo Fisher Scientific).

La Digital PCR (dPCR) è una PCR end-point che fornisce un dato mutazionale sia qualitativo che quantitativo (in copie/μL) e presenta un elevato livello di sensibilità (LOD fino allo 0,01% di frequenza allelica).

Modulistica per la richiesta degli esami

Sul modulo MO_LabOncMed_165_Catalogo delle Prestazioni di Diagnostica Molecolare è possibile prendere visione dell’elenco delle prestazioni che vengono eseguite presso il Laboratorio di Biologia Molecolare, il materiale su cui viene eseguita l’analisi, i tempi di refertazione e i moduli da compilare per la richiesta del test, che sono inoltre di seguito indicati.

Per la richiesta delle analisi molecolari, far riferimento alle istruzioni presenti nel MO_LabOncMed_166_Modulo di Istruzioni per la Richiesta delle Analisi Mutazionali.

Per la corretta compilazione della ricetta medica del Sistema Sanitario Nazionale (SSN) rossa o elettronica, è possibile consultare la tabella con i codici delle varie prestazioni da richiedere e le relative quantità, presenti nel modulo MO_LabOncMed_167_Ricetta SSN: Codici Prestazioni di Diagnostica Molecolare.

Unitamente alla ricetta SSN, per la richiesta dei singoli test, utilizzare il MO_LabOncMed_168_Modulo di Richiesta Analisi Molecolari.

Per tutti i pazienti è necessario che venga compilato, insieme al medico che richiede il test, il consenso informato MO_LabOncMed_Consenso_Informato.

 3. ESAMI DI FARMACOGENETICA

Cosa si intende per Farmacogenetica

La FARMACOGENETICA si propone di studiare le basi genetiche e in particolare le modificazioni di sequenza del DNA (le cosiddette “varianti polimorfiche” o “polimorfismi”) responsabili della variabilità interindividuale di risposta agli agenti farmacologici. L’identificazione delle varianti polimorfiche presenti nei geni codificanti gli enzimi, i recettori e le altre proteine coinvolte nella risposta farmacologica e la comprensione delle conseguenze fenotipiche ad esse associate, faciliterà la scelta del farmaco più appropriato per ogni paziente e consentirà di ridurre enormemente, fino ad evitare, la tossicità ed il fallimento terapeutico.

Applicazioni cliniche della Farmacogenetica

Presso il Laboratorio di Biologia Molecolare si svolgono principalmente due tipologie di analisi farmacogenetiche:

1. Analisi dei polimorfismi del gene DPYD

L’analisi molecolare del gene DPYD è importante ai fini della valutazione dell’eventuale tossicità alle fluoropirimidine (5-FU, capecitabina). Nonostante il trattamento con fluoropirimidine sia generalmente ben tollerato, in alcuni pazienti è stata riportata una tossicità grave e in alcuni casi letale.

Il gene DPYD codifica per il principale enzima coinvolto nel catabolismo delle fluoropirimidine, la diidropirimidina deidrogenasi (DPD). L’eventuale presenza di varianti alleliche su questo gene può pertanto essere associata a ridotta attività enzimatica, questo si traduce principalmente in un deficit della clearance del farmaco che può determinare gravi tossicità gastrointestinali ed ematologiche.

A chi è rivolto il test

L’analisi farmacogenetica DPYD è raccomandabile:

1. prima della terapia con fluoropirimidine ogni qualvolta, a giudizio dell’oncologo, il trattamento venga proposto ad un paziente con caratteristiche cliniche (comorbidità, performance status (PS), stadio di malattia) che lascino supporre un limitato impatto in termini di sopravvivenza e/o risposta e/o sia elevato il rapporto rischio/beneficio. L’analisi deve comprendere le mutazioni: c.1236G>A (c.1129–5923C>G), c.1679T>G, c.1905+1G>A e c.2846A>T;
2. nei casi di tossicità gravi o inattese comparse durante la terapia con fluoropirimidine è consigliata l’analisi delle mutazioni c.1236G>A, c.1679T>G, c.1905+1G>A, c.2846A>T e c.2194G>A qualora il paziente non le abbia precedentemente eseguite.

Come viene eseguito il test del DPYD

L’analisi molecolare viene effettuata su DNA germinale estratto da sangue periferico raccolto in una provetta con anticoagulante (EDTA).

Il test viene eseguito mediante l’utilizzo del kit CE-IVD Easy PGX Ready DPYD e relativo apparecchio EasyPGX qPCR instrument (Diatech Pharmacogenetic) e l’analisi viene eseguita utilizzando l’Easy PGX Software.

 2. Analisi dei polimorfismi del gene UGT1A1

L’analisi molecolare del gene UGT1A1 è importante ai fini della valutazione dell’eventuale tossicità alla chemioterapia con irinotecano.

Il gene UGT1A1 infatti codifica per il principale enzima coinvolto nel catabolismo dell’irinotecano, la uridina glucuronosiltransferasi isoforma 1A1 (UGT1A1). L’irinotecano può provocare grave tossicità gastrointestinale ed ematologica derivante dal deficit del suo metabolismo di coniugazione con acido glucuronico dipendente dall’enzima UGT1A1. Il gene UGT1A1 presenta una variante allelica principale della regione promoter ([TA]7TAA, UGT1A1*28, rs8175347, con ripetizioni di 7 TA) associata a bassa attività trascrizionale e ridotta attività enzimatica. Questo determina principalmente deficit di clearance che possono causare gravi tossicità gastrointestinali ed ematologiche, in particolare nei soggetti con genotipo omozigote mutato, che rende necessario ridurre il dosaggio iniziale dell’irinotecano almeno del 30% al fine di evitare i suddetti effetti di tossicità.

A chi è rivolto il test

Al fine di prevenire reazioni avverse potenzialmente molto gravi, l’analisi farmacogenetica UGT1A1 è raccomandabile:

1. prima della terapia con irinotecano ogni qualvolta, a giudizio dell’oncologo, il trattamento venga proposto ad un paziente con caratteristiche cliniche (comorbidità, PS, stadio di malattia) che lascino supporre un limitato impatto in termini di sopravvivenza e/o risposta e/o sia elevato il rapporto rischio/beneficio;
2. durante la terapia con irinotecano nei casi di tossicità gastrointestinale di grado ≥3 e/o ematologica di grado 4 e comunque in tutti i casi di tossicità gravi inattese.

Come viene eseguito il test dell’UGT1A1

L’analisi molecolare viene effettuata su DNA germinale estratto da sangue periferico raccolto in una provetta con anticoagulante (EDTA).

Il test viene eseguito mediante l’utilizzo del kit CE-IVD Easy PGX Ready UGT1A1 e relativo apparecchio EasyPGX qPCR instrument (Diatech Pharmacogenetic) e l’analisi viene eseguita utilizzando l’Easy PGX Software.

Modulistica per la richiesta degli esami

Sul modulo MO_LabOncMed_165_Catalogo delle Prestazioni di Diagnostica Molecolare è possibile prendere visione dell’elenco delle prestazioni che vengono eseguite presso il Laboratorio di Biologia Molecolare, il materiale su cui viene eseguita l’analisi, i tempi di refertazione e i moduli da compilare per la richiesta del test, che sono inoltre di seguito indicati.

Per la richiesta delle analisi molecolari, far riferimento alle istruzioni presenti nel MO_LabOncMed_166_Modulo di Istruzioni per la Richiesta delle Analisi Mutazionali.

Per la corretta compilazione della ricetta medica del Sistema Sanitario Nazionale (SSN) rossa o elettronica, è possibile consultare la tabella con i codici delle varie prestazioni da richiedere e le relative quantità, presenti nel modulo MO_LabOncMed_167_Ricetta SSN: Codici Prestazioni di Diagnostica Molecolare.

Unitamente alla ricetta SSN, per la richiesta dei singoli test, utilizzare il MO_LabOncMed_168_Modulo di Richiesta Analisi Molecolari.

Per tutti i pazienti è necessario che venga compilato, insieme al medico che richiede il test, il consenso informato MO_LabOncMed_Consenso_Informato.

Cosa si intende per Analisi dell’Instabilità dei Microsatelliti (MSI)

I microsatelliti sono brevi sequenze di DNA ripetute da 15 a 30 volte e disperse nel genoma umano. Proprio per la loro natura, sono maggiormente esposti a variazioni della loro lunghezza durante la replicazione. Il mancato funzionamento del sistema di riparazione del MisMatch Repair (MMR) impedisce la correzione di questi errori favorendo l’instabilità delle sequenze microsatellite. Pertanto, l’instabilità dei microsatelliti (microsatellite instabiity, MSI) può essere considerata come un marcatore del mancato funzionamento del sistema di riparazione del MMR presente in diversi tipi di tumori, tra i quali i più rappresentati sono il tumore del colon, dell’endometrio ed i tumori gastrici. La MSI rappresenta la principale alterazione genetica (~90-95%) nella sindrome di Lynch (o cancro colon-rettale ereditario non poliposico, HNPCC) ed è riscontrata nel 15% dei tumori colon-rettali sporadici.

Applicazioni cliniche dell’Instabilità dei Microsatelliti

Gli scenari clinici in cui viene richiesta l’analisi dell’instabilità dei microsatelliti (MSI) sono principalmente due:

1. come test di screening in tutti i pazienti con sospetta Sindrome di Lynch per identificare un deficit del MMR che la caratterizza (Vedi anche TEST GENETICI-Test genetici per la predisposizione al cancro).
2. nei pazienti con carcinoma del colon-retto (CRC) in stadio II, come ausilio nella decisione della somministrazione o meno della terapia adiuvante, vista la prognosi estremamente favorevole di questi pazienti.

In base all’analisi della MSI, il CRC può essere distinto in due diverse categorie: tumori con MMR difettivo e con alti livelli di instabilità dei microsatelliti (MSI-H, circa il 15%) e tumori con MMR funzionante e con bassi livelli di MSI (MSI-L, circa l’85%). I CRC MSH-H sono associati ad un elevato tasso di mutazione, infiltrazione di cellule immunitarie e prognosi migliore rispetto ai tumori con MSI basso o assente.

NOTA: Uno scenario emergente, ma non ancora approvato in Europa, è quello riguardante l’analisi della MSI, in diversi tipi istologici di tumore, come fattore predittivo di risposta all’immunoterapia, in particolare alla terapia con inibitori di PD-1/PD-L1.

Come viene eseguito il test

Il test viene eseguito su DNA estratto da sezioni di tessuto tumorale fissato in formalina e incluso in paraffina (FFPE), in cui sia indicata la zona tumorale e la relativa percentuale di cellule tumorali presenti, mediante l’utilizzo del kit CE-IVD Easy PGX Ready MSI e relativo apparecchio EasyPGX qPCR instrument (Diatech Pharmacogenetic).

Questo kit consente il rilevamento di 8 marcatori “quasi-monomorfici” mononucleotidici: BAT-25, BAT-26, NR-21, NR-22, NR-24, NR-27, CAT-25 e MONO-27 mediante PCR Real Time e successiva analisi dei target mediante l’utilizzo del Easy PGX Software.

Talvolta potrebbe essere necessario anche il DNA estratto da sangue periferico raccolto in una provetta con anticoagulante (EDTA).

Modulistica per la richiesta degli esami

Sul modulo MO_LabOncMed_165_Catalogo delle Prestazioni di Diagnostica Molecolare è possibile prendere visione dell’elenco delle prestazioni che vengono eseguite presso il Laboratorio di Biologia Molecolare, il materiale su cui viene eseguita l’analisi, i tempi di refertazione e i moduli da compilare per la richiesta del test, che sono inoltre di seguito indicati.

Per la richiesta delle analisi molecolari, far riferimento alle istruzioni presenti nel MO_LabOncMed_166_Modulo di Istruzioni per la Richiesta delle Analisi Mutazionali.

Per la corretta compilazione della ricetta medica del Sistema Sanitario Nazionale (SSN) rossa o elettronica, è possibile consultare la tabella con i codici delle varie prestazioni da richiedere e le relative quantità, presenti nel modulo MO_LabOncMed_167_Ricetta SSN: Codici Prestazioni di Diagnostica Molecolare.

Unitamente alla ricetta SSN, per la richiesta dei singoli test, utilizzare il MO_LabOncMed_168_Modulo di Richiesta Analisi Molecolari.

Per tutti i pazienti è necessario che venga compilato, insieme al medico che richiede il test, il consenso informato MO_LabOncMed_Consenso_Informato.

Nel caso in cui l’analisi debba essere eseguita su tessuto tumorale conservato presso l’Anatomia Patologica dell’Ospedale di Perugia, per richiedere le sezioni è necessario compilare la delega Modulo delega AP da inviare insieme alla carta d’identità del paziente (vedi MO_LabOncMed_166_Modulo di Istruzioni per la Richiesta delle Analisi Mutazionali).